Биогенез мембран

p align="left">Определение старт- и стоп-сигналов подразумевает линейную схему переноса, начинающегося с N-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Однако оказалось, что последовательности, которые блокируют перенос в одном случае, могут инициировать его в другом. Следовательно, важна не только природа самих стоп- или старт-последовательностей, но и их окружение в полипептиде.

Вторичные сигналы экэоцитозной системы

Функция сигнального пептида состоит в направлении белков в эндоплазматический ретикулум и в инициации переноса. Из рис. 10.1 видно, что как мембранные белки, так и растворимые белки, которые попадают в полость эндоплазматического ретикулума, имеют несколько мест назначения. Информация, определяющая их локализацию, каким-то образом кодируется в зрелом полипептиде. В отсутствие вторичного сигнала водорастворимые белки секрети-руются с помощью «конститутивной» секретирующей системы. Достигнуты определенные успехи в идентификации сигналов, ответственных за направление растворимых белков в лизо-сомы или секреторные гранулы либо за удержание их в эндоплаз-матическом ретикулуме или пузырьках Гольджи. Возможно, участки этих полипептидов взаимодействуют с мембранными рецепторами, вызывая замедление их экспорта.

О сигналах, ответственных за локализацию интегральных мембранных белков в экэоцитозной системе, известно немного. По-видимому, за фиксацию белка Е19 аденовируса в мембране эндоплазматического ретикулума отвечает короткая последовательность на С-конце молекулы. Этот белок имеет единственный трансмембранный сегмент и цитоплазматический «хвост» из 15 остатков на С-конце. Уменьшение длины «хвоста» только на восемь аминокислотных остатков приводит к транспорту белка из эндоплазматического ретикулума. Возможно, сигнальный участок взаимодействует прямым или косвенным образом с некой цитоплазматической структурой, что обеспечивает заякоривание белка Е19 в эндоплаз-матическом ретикулуме. Исследования гликопротеина Е1 коронави-руса показали, что сигнальная последовательность, ответственная за его нахождение в аппарате Гольджи, локализована в одной из трех предполагаемых трансмембранных спиралей.

Сходная проблема сортировки возникает при выявлении вторичных сигналов, ответственных за направление мембранных белков в нужный домен плазматической мембраны в поляризованных эпителиальных клетках. В этой работе использовались в основном вирусы с оболочкой, которые отпочковываются либо от апикальной, либо от базолатеральной поверхности эпителиальных клеток в культуре. Так, G-белок вируса везикулярного стоматита локализован исключительно в базолатеральной области мембраны, от которой вирус и отпочковывается, а гликопротеин гемагглютинина транспортируется к апикальной области. Химерный гибрид,

Таблица 1. Сигналы для сортировки белков в эукариотических клетках

		нанты аминокислотной последовательности
		неизвестны
2.	Эндоплазматиче-	Короткая последовательность на С-
	ский ретикулум	коице отвечает за удерживание некоторых
		мембранных компонентов и компонентов
		просвета эндоплазматического ретикулума
3.	Аппарат Гольджи	Сигнальная последовательность находится	[899)
		в одном из трансмембраниых сегментов
		гликопротеииа Е1 короиавируса
4.	Апикальная или ба-	В некоторых случаях сигнал, определяю-	[937, 958,
	золатеральная об-	щий конечную локализацию, содержит	1186]
	ласть плазматиче-	внецитоплазматический домеи, но какую-
	ской мембраны	то роль может также играть цито-
		плазматический домен
5.	Секреторные	Сигнал для трипсиногеиа не требует нали-	(1249]
	гранулы	чия сигнального пептида (первичный сиг-
		нал) или первых 12 аминокислотных
		остатков на N-коице нативиого белка
6.	Конститутивная	Укороченный путь в отсутствие вторич-
	секреция	ных сигналов

состоящий из внецитоплазматического домена НА, а также мембранного сегмента и цитоплазматического «хвоста» G-белка, локализуется исключительно в апикальной области мембраны. Эти и другие эксперименты свидетельствуют о том, что решающее значение для локализации имеет внецитоплазматический домен. Однако существуют данные о том, что цитоплазматический домен тоже может содержать важные сортировочные детерминанты. По-видимому, сортировка белков плазматической мембраны в поляризованных эпителиальных клетках происходит в аппарате Гольджи. Однако в гепатоцитах крысы наблюдается иная картина: все белки плазматической мембраны, очевидно, направляются сначала в базолатериальную область.

Существенно, что вторичные сортирующие детерминанты содержатся в средней части зрелого полипептида и не являются родственными и даже не соседствуют с первичным сигнальным пептидом, ответственным за начальную локализацию в эндоплазматическом ретикулуме. Этим они отличаются от большинства вторичных сортирующих сигналов митохондрий и хлоропластов, а также, вероятно, бактерий.

Сигналы переноса и сортировки у бактерий

Большинство работ по сборке и переносу мембранных белков были выполнены на Е. coli. Белок, синтезируемый в цитоплазме, может направляться к цитоплазматической мембране, в периплаз-матическое пространство или в наружную мембрану. Перенос белков через внутреннюю мембрану в периплазматическое пространство или наружную мембрану часто называют экспортом. Кроме того, некоторые белки транспортируются через обе мембраны и секретируются во внешнюю среду или становятся компонентами пилей. В основном исследовался экспорт из бактериальных клеток, который имеет много общего с импортом в эндоплазматический ретикулум.

Как правило, белки, направляемые в периплазматическое пространство нли в наружную мембрану, имеют временные N-конце-вые сигнальные пептиды, весьма сходные с пептидами секретируе-мых белков, которые импортируются в эндоплазматический ретикулум эукариотических клеток. И в самом деле, сигнальные пептиды про- и эукариот до определенной степени взаимозаменяемы и узнаются в гетерологических системах. Например, сигнальный пептид липопротеина наружной мембраны Е. coli ускоряет перенос белков через микросомы животных клеток. Сигнальные пептиды эукариот и известные сигнальные пептиды прокариот негомологичны. За очень редким исключением, белки плазматической мембраны не содержат отщепляемого сигнального пептида. К таким исключениям относятся белок оболочки фага М13, не происходящий из Е. coli, и пенициллинсвязывающие белки, которые локализуются не только в цитоплазматической мембране. Генетические данные подтверждают, что в основе переноса экспортируемых белков и сборки белков плазматической мембраны лежат одинаковые биохимические механизмы и осуществляются эти процессы в соответствии со сходными механистическими принципами.

Напротив, механизм секреции белков через цитоплазматическую и наружную мембраны может быть совершенно иным. Например, у гемолизина сигнальная последовательность, определяющая секрецию, находится иа С-концевом участке длиной 27 аминокислот, а не на N-конце. Замечательно, что серекция токсина, продуцируемого грамотрицательной бактерией Vibrio cholerae, через наружную мембрану происходит только после свертывания полипептида с образованием третичной и четвертичной структуры в периплазма-тическом пространстве.

По данным генетического анализа, существует не менее четырех генов, продукты которых необходимы для переноса большинства белков оболочки через цитоплазматическую мембрану: secA, secB, secY и secD. Продукты генов secA и secY участвуют в сборке по крайней мере некоторых белков цитоплазмати-ческой мембраны, таких, как лидерная пептидаза. Функции продуктов этих генов неизвестны; возможно, они непосредственно участвуют в переносе белков. Биохимические исследования, проводимые в этой области, гораздо более трудоемки, чем генетические. Работы с использованием мутантов, дефектных по серекции белков, не выявили никаких механистических деталей; тем не менее полученные данные подтвердили наличие тесной связи между процессами секреции и трансляции белков in vivo. О такой связи свидетельствуют и биохимические данные, хотя в некоторых случаях in vivo белок включается в мембрану по завершении трансляции. Однако продукт гена secY способен к посттрансляционному функционированию. Возможно, он представляет собой мембраносвязанный рецептор или каналообразую-щий белок, взаимодействующий с сигнальным пептидом бактерий.

Дополнительные детерминанты первичного сигнала

В некоторых случаях наличие сигнального пептида у экспортируемых белков достаточно для переноса белков-пассажиров через ци-топлазматическую мембрану. Примером может служить сигнальная последовательность у ОтрА. С другой стороны, оказалось, что транспорт белка наружной мембраны LamB возможен лишь при наличии определенной части последовательности зрелого полипептида. Рэндолл и др. показали, что мальтозосвязываю-щий белок, синтезируясь на мембраносвязанных рибосомах, не переносится в периплазматическое пространство до тех пор, пока трансляция не пройдет примерно на 80%. Это указывает на определенную роль различных частей зрелой последовательности в инициации трансляции, хотя не исключаются и другие объяснения.

Исследования, проведенные на двух белках цитоплазматической мембраны, белке оболочки фага М13 и лидерной пептидазе, показывают, что для белков, кроме N-коицевой сигнальной последовательности, по-видимому, необходимы какие-то структурные детерминанты. Более характерным белком цитоплазматической Мембраны является лидер-пептидаза; ее предполагаемая топология представлена на рис. 10.12. Этот фермент ответствен за про-теолитическое отщепление сигнального пептида от большинства экспортируемых белков Е. coli; его активный центр локализован на периплазматической стороне цитоплазматической мембраны. Молекула этого белка имеет два транс

мембранных сегмента и большой С-концевой домен, экспонированный в периплазматическое пространство. Делеция остатков 142--323 блокирует перенос неполного полипептида через цитоплазматическую мембрану, что согласуется с представлением о важной роли в переносе карбоксильной части молекулы. Полипептид, лишенный остатков 4--50, которые образуют первый трансмембраиный сегмент, по-прежнему собирается в мембране, а второй трансмембранный сегмент играет роль сигнального пептида.

Таким образом, исследование некоторых белков Е. coli свидетельствует о том, что для переноса через цитоплазматическую мембрану необходима информация, закодированная в такой структуре, которая находится за пределами сигнальной последовательности. Возможно, это просто отражает тот факт, что искусственные полн-пептидные конструкции, используемые в данных исследованиях, имеют конформацию, не способствующую переносу. А может быть, это связано с наличием характерных детерминант, необходимых для взаимодействия с компонентами механизма переноса.

Вторичные сигналы

Что направляет белки во внутреннюю мембрану, периплазматическое пространство или наружную мембрану -- неизвестно. Генетические исследования, а также данные по конкурентным взаимодействиям показывают, что многие из этих белков используют общий биохимический аппарат переноса. Результаты анализа сигнальных пептидов свидетельствуют о том, что небольшие изменения их гидрофобности и размера могут приводить к существенным изменениям в локализации переносимого белка. С другой стороны, сигнальная последовательность периплазматиче-ского белка может с успехом замещать сигнальную последовательность белка наружной мембраны; это означает, что информация о сборке заключена в зрелом белке наружной мембраны. Возможно, перемещение белка именно к плазматической мембране обусловлено просто наличием стоп-сигнала. Вспомним, что основные белки наружной мембраны, в том числе порины, лишены гидрофобных трансмембранных сегментов.

Использование синтетических сигнальных пептидов

Синтезированы пептиды, соответствующие сигнальной последовательности дикого типа, а также мутантные сигнальные пептиды белка LamB наружной мембраны и исследовано их взаимодействие с модельными фосфолипидными мембранами и везикулами Е, coli. Показано, что пептид, соответствующий сигнальной последовательности дикого типа, эффективно ингибирует in vitro перенос предшественников как периплазматического белка, так и белка наружной мембраны, а пептид, соответствующий мутантной сигнальной последовательности, дефектной по экспорту, не ингибирует перенос в бесклеточной системе. Это означает, что сигнальные пептиды узнают какой-то общий рецептор в цитозольной или мембранной фракции. Кроме того, эффективность связывания этих пептидов с модельными мембранами коррелирует с их способностью служить сигналом переноса. Корреляция между гидрофобностью сигнальной последовательности и способностью инициировать транслокацию обнаруживается и при использовании предшественника мальтозосвязывающего белка.

Эти данные согласуются с моделью, согласно которой первичная сигнальная последовательность определяет локализацию полипептидного предшественника в мембране путем неспецнфических взаимодействий с липидным бислоем, после чего осуществляется более специфическое связывание с белковым рецептором. Сходная модель была предложена для амфифильных пептидных гормонов. Заметим, однако, что сигнальный пептид в животных клетках до его связывания с мембраной взаимодействует с каким-то растворимым рецептором. Какое значение для сигнального пептида имеет его способность связываться с липида-ми -- остается неясным.

Другие сигнальные последовательности бактерий

Имеются данные о том, что у бактерий существуют сигналы, отличные от сигналов у Е. coli. Особый интерес представляет уникальная сигнальная последовательность, содержащаяся в бактерио-родопсине Н. halobium. Этот белок синтезируется in vivo с N-концевым сигналом длиной 13 остатков, который в принципе может образовать амфифильную а-спираль. Он сильно отличается от сигнальной последовательности Е. coli, и о его функционировании почти ничего не известно.

Сигнальные проследовательности импорта и сортировки в митохондриях

Белки митохондрий и хлоропластов, информация о которых закодирована в ядре, синтезируются в виде водорастворимых предшественников на свободных рибосомах и in vivo переносятся к месту назначения после трансляции. В результате сортировки мито-хондриальные белки оказываются в наружной мембране, межмембранном пространстве, внутренней мембране или в матриксе. Эксперименты с использованием химерных полипептидов или полипептидов, полученных в результате делеций, показали, что, как правило, достаточная для импорта и сортировки информация содержится на N-конце. Большинство белков митохондрий и хлоропластов синтезируется с N-концевыми препоследовательностя-ми, которые удаляются сигнальными пептидазами во время или после переноса. Эти препоследовательности содержат информацию, необходимую для импорта и сортировки. Например, первые 22 аминокислоты IV субъединицы цитохром с-оксидазы, присоединенные к дигидрофолатредуктазе мыши, детерминируют импорт цито-зольного фермента в матрикс митохондрий. В общем случае в отсутствие дополнительных сигналов сигнал импорта направляет белок-пассажир в матрикс. Это «укороченный» путь, аналогичный конститутивной секреции белков, импортируемых в эндоплазматический ретикулум. Дополнительные сигналы сортировки, как правило, тоже находятся в препоследовательности, за сигналом импорта. Например, если препоследовательность цитохрома с присоединена к тетрагидрофолатредуктазе, то белок-пассажир локализуется в межмембранном пространстве. Даже в тех немногих случаях, когда отщепляемая сигнальная последовательность отсутствует, сигналы сортировки и импорта находятся на N-конце полипептида. Впрочем, в некоторых работах имеются указания на то, что какую-то роль в импорте митохондриальных белков играют последовательности, отличные от тех, которые расположены вблизи N-конца.

На рис. 10.13 суммированы данные о структуре сигнальных последовательностей типичных митохондриальных белков. У всех них на N-конце находится последовательность, определяющая транспорт белков в матрикс, а также при необходимости содержится дополнительная сигнальная информация.

Белки наружной мембраиы

Наиболее детально изучен белок наружной мембраны дрожжей с мол. массой 70 кДа. Как и другие белки наружной мембраны, он не содержит отщепляемого сигнального пептида, и сигнальной последовательностью, ответственной за его транспорт в матрикс, служит N-конец. Это было показано в опытах по присоединению первых 12 аминокислот исследуемого белка к цитозольному белку, в результате чего белок-пассажир оказывался в матриксе митохондрии. Сигнал сортировки, который определяет локализацию белка мол. массой 70 кДа в наружной мембране, по-видимому, представляет собой сегмент из 28 незаряженных аминокислот, примыкающий к сигнальной последовательности, ответственной за транспорт белка в матрикс. Деления лишь двух из этих незаряженных остатков приводит к транспорту белка в матрикс. Заметим, что митохондриальный импорт, по-видимому, осуществляется через каналы, находящиеся в местах соединения внутренней и наружной мембран. В отличие от примера, приведенного на рис. 10.8, сборка белка с мол. массой 70 кДа не требует наличия трансмембранного потенциала, что типично для белков наружной мембраны. Простейшая схема сборки белка с мол. массой 70 кДа состоит в том, что гидрофобный участок, закрепляющий белок в наружной мембране, играет роль стоп-сигнала переноса, в результате основная часть белка остается вне митохондрии. Сборка другого исследованного белка наружной мембраны, порина из Neurospora crassa, вероятно, осуществляется с,помощью другого механизма. Этот белок не содержит гидрофобного участка и, подобно поринам бактерий, по-видимому, представлен трансмембранной /3-структурой.

Межмембран нов пространство

Типичным представителем белков, содержащихся в межмембранном пространстве, является цитохром Ьг. Его пре-последовательность состоит из 80 остатков, составляющих два разных участка. N-концевая часть препоследовательности служит сигналом, направляющим целый полипептид в матрикс. Этот процесс зависит от наличия потенциала на внутренней мембране. В резуль-

тате протеолитического процессинга, осуществляемого сигнальной пептидазой в матриксе, N-концевой участок препоследовательности удаляется и освобождается вторая часть сигнала, которая направляет полипептид обратно через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. Этот этап не требует наличия мембранного потенциала. В результате второго акта протеолиза на наружной поверхности внутренней мембраны образуется водорастворимая зрелая форма белка. Сходным образом происходит импорт железосе-росодержащей себъединицы Риске bci-комплекса, но в этом случае весь протеолитический процессинг осуществляется внутри матрикса. Заметим, что процесс переноса белков из матрикса очень похож на процесс экспорта белков из бактерий.

Для объяснения импорта цитохрома с,, другой субъединицы Ьс\-комплекса, были предложены два механизма. Один из них сходен с механизмом, описанным выше для цитохрома bi, другой представлен на рис. 10.14. В этом случае препоследовательность весьма протяженная и очень похожа на таковую у цитохрома Ьг. Предполагается, что белок, направляемый N-концевой сигнальной последовательностью, транспортируется в матрикс до тех пор, пока перенос не блокируется гидрофобным сегментом из 19 незаряженных остатков на С-кон-це препоследовательности. Белок закрепляется на внутренней мембране, как это схематически показано на рис. 10.14. Как только перенос цитохрома С\ прекращается, две сигнальные пептидазы, одна в матриксе, а другая в межмембранном пространстве, отщепляют препоследовательность, в результате чего образуется зрелый белок, который собирается в мультисубъединичный Ьокомплекс. Зрелый белок, вероятно, фиксируется во внутренней мембране с помощью С-концевой гидрофобной спирали. Заметим, что механизм импорта цитохрома с в межмембранное пространство, по-видимому, уникален. В этом случае отщепляемая препоследовательность отсутствует; вероятно, белок имеет свой собственный специфический рецептор.

Страницы: 1, 2, 3, 4